Soutenance de thèse - Célia Ait Mouhoub

Célia Ait Mouhoub (équipe BMP) a le plaisir de vous convier à sa soutenance de thèse intitulée "Etude des interactions entre la protéine NS1 du Virus Respiratoire Syncytial et ces partenaires cellulaires" réalisée sous la direction de Monika Bajorek au sein de l’équipe BMP.  Sa soutenance aura lieu le jeudi 2 octobre à 14h dans l’amphithéâtre Jacques Poly du bâtiment 440 du centre INRAE de Jouy-en-Josas.  

Le jury est composé de : Cecilia Johansson (Professeure des Universités à l’Imperial College de Londres), Caroline Goujon (Directrice de recherche, IRIM, Montpellier), Marie-Anne Rameix-Welti (Professeure des Universités et praticienne hospitalière, Institut Pasteur) et de Jean Millet (Chargé de Recherche, Inrae de Jouy-En-Josas).

Résumé : Le virus respiratoire syncytial humain est la principale cause de bronchiolite et de pneumonie infantile dans le monde. De même, le VRS bovin provoque une morbidité et une mortalité importantes chez les veaux. Le VRS induit une réponse immunitaire innée faible, en partie médiée par la protéine non structurale NS1. NS1 se localise dans le cytoplasme et le noyau, où elle semble interférer avec la transcription des gènes de l'hôte, bien que les mécanismes moléculaires restent mal connus. Un criblage protéomique récent a révélé des cibles nucléaires de la protéine NS1, notamment la sous unité Med25 du complexe Médiateur, un coactivateur transcriptionnel de la machinerie de l’ARN polymérase II. Ce complexe régule la transcription de plusieurs gènes impliqués dans la réponse antivirale. De précédent résultats indiquent que le domaine N-terminal α3 et le domaine α,β-core de NS1 interagissent avec le domaine ACID de Med25. Cependant, la contribution exacte de chaque domaine reste à déterminer, notamment pour le domaine αβ-core. Ainsi, l’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du complexe NS1-Med25 dans la réplication du VRS et son implication dans la réponse immunitaire innée. Nous avons utilisé AlphaFold3 afin de prédire l'interaction entre NS1 de pleine longueur et le domaine ACID de Med25, et nous avons identifié cinq acides aminés spécifiques présents sur le domaine α,β-core de NS1, essentiels pour la liaison avec Med25. Des expériences de RMN et d'interaction biochimique, ainsi que des tests de liaison protéine/protéine via le système Split-Nano-Luciférase en cellules ont démontrés que plusieurs substitutions d'alanine du domaine α,β-core de NS1, situées dans l'interface, affectent négativement l'interaction entre NS1 et le domaine ACID de Med25, tout comme la délétion du domaine α3. A partir de cela, nous avons générés cinq virus recombinant (rVRS) m-Cherry porteurs de ces mutations. Ces mutations ont induit, chez les rVRS, une atténuation de la réplication ainsi qu’une réduction de la formation des syncytia dans les cellules épithéliales compétentes pour l’IFN. Ces mêmes mutants ont entraîné une augmentation significative de la transcription de certains ISG comparé au rVRS sauvage, sans effet sur l’expression ainsi que la production d’interféron de type I et III, suggérant que l’interaction NS1-Med25 a lieu en aval de la voie d’induction de l’IFN. Dans les cellules dépourvues de Med25, la réplication des rVRS était atténuée, aussi bien pour le VRS sauvage que pour les différents mutants de NS1, et l’avantage du VRS sauvage par rapport aux mutants était perdu, suggérant un effet proviral de Med25. Le rôle du complexe NS1–Med25 a également été étudié dans des macrophages alvéolaires primaires. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que le domaine α,β-core et α3 de NS1 interagissent coopérativement et avec un double site de liaison avec le domaine ACID de Med25. Cette interaction module la transcription des ISGs. En parallèle, nous avons étudié le rôle de NS1 dans la barrière d’espèce. Un criblage en double-hybride chez la levure a permis d’identifier un partenaire cellulaire de NS1 bovin (bNS1), l’ubiquitine ligase bovine RNF135 (bRNF135) impliquée dans la voie RIG-I. Chez l’humain, il a été montré que NS1 interagissait avec Trim25, une autre ubiquitine ligase de la voie RIG-I, au niveau de son domaine SPRY. Sur la base de ces résultats, des expériences de co-immunoprécipitation ont été réalisés afin de valider l’interaction entre les deux partenaires. Nous avons constaté que cette interaction se produisait uniquement entre bNS1 et le domaine SPRY de bRNF135, et qu’aucune interaction n’était observée avec hNS1. En outre, nous avons établi que l’interaction entre bNS1 et bRNF135 SPRY était médiée par via le domaine α,β-core de NS1. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que NS1 semble jouer un rôle dans la barrière d’espèce entre les VRS humain et bovin via une interaction spécifique dans le cytoplasme affectant l’activation de RIG-I.

Abstract : Human respiratory syncytial virus (hRSV) is the leading cause of bronchiolitis and pneumonia in infants worldwide. Similarly, bovine RSV (bRSV) causes morbidity and mortality in calves. RSV elicits a weak innate immune response, partially mediated by the non-structural NS1 protein. NS1 is found in the cytosol and the nucleus, where it appears to interfere with host gene transcription; however, the molecular mechanisms underlying this interaction remain unclear. Recent proteomic screening has revealed nuclear targets for NS1, including the Med25 subunit of the Mediator complex, a transcriptional coactivator of the RNA polymerase II machinery. This complex regulates transcription of several genes involved in the antiviral response. Previous results indicate that the NS1 α3 helix interacts with the Med25 ACID domain; however, little is known about the contribution of other NS1 domains, such as the α,β-core. My thesis primarily focuses on investigating the role of the NS1-Med25 complex in RSV replication and the innate immune response. We used AlphaFold3 to predict the interaction between NS1 full-length and the Med25 ACID domain and identified five specific amino acids on NS1 α,β-core essential for the binding of MED25: I54, F54, E110, K112, and M122. NMR and biochemical interaction assays, as well as binding assays using the Split-Nano-Luciferase system in cells, have demonstrated that several NS1 α,β-core domain alanine substitutions negatively affected the NS1−Med25 ACID interaction, similar to the α3 deletion. Based on this, we rescued five recombinant m-Cherry RSV (rRSV) NS1 mutants carrying these mutations. These mutations attenuated rRSV-mCherry replication and reduced syncytia formation in interferon-competent epithelial cells. rRSV-mCherry NS1 mutants that were attenuated in cells induced higher transcription levels of several antiviral ISGs, but had no impact on the type I and III interferon expression and production, suggesting that NS1-Med25 interaction occurs downstream of the IFN production pathway. In cells depleted for Med25, rRSV-mCherry replication was attenuated for WT as well as NS1 mutant, and the advantage of NS1 WT over NS1 mutants was lost, suggesting a pro-viral effect of Med25. The role of the NS1-Med25 complex was also investigated in primary alveolar macrophages (AMs). Taken together, these findings suggest that both NS1 α,β-core and the α3 domain interact cooperatively and with a dual binding site with the Med25 ACID domain. This interaction modulates the ISGs transcription. In parallel, we investigated the role of NS1 in the host species barrier. Yeast double-hybrid screen identified a new cellular partner of bovine NS1 (bNS1), the bovine ubiquitin ligase RNF135 (bRNF135) of the RIG-I pathway. In humans, it was shown that NS1 interacts with Trim25, another ubiquitin ligase of RIG-I, and specifically with the SPRY domain. Based on this, we conducted a co-immunoprecipitation assay to validate the interaction between the two partners and found that this interaction occurs solely between bNS1 and bSPRY of RNF135, with no interaction observed with hNS1. Furthermore, we established that the bNS1/bRNF135 SPRY interaction was mediated through the NS1 α,β-core domain. Our results suggest that NS1 may play a role in the species barrier between human and bovine RSV through specific interaction in the cytoplasm that affects RIG-I activation, therefore leading to the inhibition of IFN production.