Soutenance de thèse - Mantasha Khan

Mantasha Khan (équipe COV) a le plaisir de vous convier à sa soutenance de thèse intitulée "Development and Functional Characterization of Artificial Proteins (alpha-Rep) Targeting the Spike Protein of Animal Coronaviruses".  Sa soutenance aura lieu le lundi 13 octobre à 14h dans l’amphithéâtre Jacques Poly du bâtiment 440 du centre INRAE de Jouy-en-Josas.  

Abstract: Animal coronaviruses provide significant risks to veterinary health and the agricultural economy. Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) and Porcine Epidemic Diarrhoea Virus (PEDV) cause a severe diarrhoea in piglets associated with high mortality rates. In addition to its enteric tropism, TGEV (and other animal coronaviruses) can also target the respiratory epithelium. While TGEV is now well controlled, PEDV is a re-emerging pathogen whose variants are less or no more sensitive to vaccines. Both the tissue tropism of animal coronaviruses and their escape to antibodies are associated with mutations in the Spike gene. Spike is a key protein because it allows virus attachment to host cells as well as cellular and viral membranes fusion, eventually allowing virus entry. While the Spike of TGEV has been quite well characterized, the functioning of PEDV Spike remains poorly understood. My main research aimed to identify original synthetic ligands capable of binding the Spike proteins of TGEV and PEDV, allowing to develop a new class of antivirals as well as tools to study Spike action mechanism.

First, we screened a phage-display library of biosynthetic proteins (the αReps) to discover potential candidates that recognize and attach to PEDV and TGEV Spikes. We used as baits the S1 region of PEDV and TGEV Spikes because S1 contains functional domains involved in cellular attachment. αReps TGE-D9 and PED-D12 were shown to bind TGEV and PEDV viral particles, thus demonstrating their ability to recognize the functional Spike protein displayed at the surface of virions. To study TGE-D9, we set up a TGEV pseudovirus and demonstrated that its entry was inhibited by this ligand at nanomolar concentrations.

In contrast, using a quantitative fluorescent reporter system of the cell-cell fusion triggered by PEDV Spike, we discovered that PED-D12 massively increases the fusion. PED-D12 was further shown to bind PEDV Spike with a high affinity, opening the way to perform structural studies of the PED-D12/PEDV Spike complex. The mechanism of action of PED-D12 (transition from a pre-fusion to post-fusion state in the PEDV Spike, receptor mimicry, facilitation of a protease cleavage, etc.) is now studied and will help understanding the functioning of this protein.

In parallel of my main project, I participated in the study of antiviral activity of small-molecule inhibitors of cyclophilins, cellular factors that facilitate coronavirus replication. In particular, I used the viral systems I developed to study porcine coronaviruses to assess the anti-TGEV and PEDV activity of an antiviral molecule (called F83233) that was shown in collaboration to potently inhibit the Feline Infectious Peritonitis Virus (FIPV) infectivity. This study highlights the efficacy of this host-targeting agent in feline, porcine, and simian cells at non-toxic concentrations. Overall, my research helps to define the molecular mechanisms of coronavirus Spike protein functioning and identifies potential antivirals. Future research will focus on improving these therapeutic strategies and further exploring their application to other coronaviruses, aiming to improve animal health and reduce their economic impact.

Résumé : Les coronavirus animaux présentent des risques importants pour la santé vétérinaire et l'économie agricole. Le virus de la gastro-entérite transmissible (TGEV) et le virus de la diarrhée épidémique porcine (PEDV) provoquent une diarrhée sévère chez les porcelets, associée à des taux de mortalité élevés. Outre son tropisme entérique, le TGEV (et d'autres coronavirus animaux) peut également cibler l'épithélium respiratoire. Alors que le TGEV est désormais bien maîtrisé, le PEDV est un pathogène réémergent dont les variants sont moins, voire plus du tout sensibles aux vaccins. Le tropisme tissulaire des coronavirus animaux et le fait qu'ils échappent aux anticorps sont associés à des mutations du gène Spike. Spike est une protéine clé car elle permet l'attachement du virus aux cellules hôtes ainsi que la fusion des membranes cellulaires et virales, ce qui permet l'entrée du virus. Alors que le Spike du TGEV a été assez bien caractérisé, le fonctionnement du Spike du PEDV reste mal compris. Mes recherches visaient principalement à identifier des ligands synthétiques originaux capables de lier les protéines Spike du TGEV et du PEDV afin de développer une nouvelle classe d'antiviraux ainsi que des outils pour étudier le mécanisme d'action du Spike.

Tout d'abord, nous  avons criblé une librairie de protéines synthétiques par phage-display (les αReps) afin de découvrir des candidats potentiels qui reconnaissent et se lient aux Spikes de PEDV et TGEV. Pour ce faire, nous avons utilisé comme appât la région S1 du Spike de ces virus, car S1 contient des domaines fonctionnels impliqués dans l'attachement à la cellule. Les αReps TGE-D9 et PED-D12 se sont révélées capables de se lier aux particules virales TGEV et PEDV, démontrant ainsi leur capacité à reconnaître la protéine Spike « fonctionnelle » présente à la surface des virions. Pour étudier le TGE-D9, nous avons développé et caractérisé un pseudovirus-TGEV et démontré que son entrée était inhibée par ce ligand à des concentrations de l’ordre du nanomolaire.

À l’inverse, en utilisant un système rapporteur fluorescent de la fusion cellule-cellule déclenchée par le Spike de PEDV, nous avons découvert que PED-D12 augmente massivement la fusion. Il a également été démontré que PED-D12 se lie au Spike de PEDV avec une très bonne affinité, ce qui ouvre la voie à des études structurales du complexe PED-D12/PEDV Spike. Le mécanisme d'action de PED-D12 (transition d'un état de pré-fusion à un état de post-fusion dans le Spike, mimétisme des récepteurs, facilitation du clivage d'une protéase, etc.) est maintenant étudié et aidera à comprendre le fonctionnement de cette protéine.

Parallèlement à mon projet principal, j'ai participé à l'étude de l'activité antivirale de petites molécules inhibitrices des cyclophilines, des facteurs cellulaires qui facilitent la réplication des coronavirus. En particulier, j'ai utilisé les systèmes viraux que j'ai développés pour étudier les coronavirus porcins afin d'évaluer l'activité anti-TGEV et PEDV d'une molécule antivirale (appelée F83233) qui a été montrée en collaboration pour inhiber puissamment l'infectivité du virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV). Cette étude met en évidence l'efficacité de cet agent ciblant l'hôte dans les cellules félines, porcines et simiennes à des concentrations non toxiques.

Dans l'ensemble, mes recherches contribuent à définir les mécanismes moléculaires du fonctionnement de la protéine Spike du coronavirus et à identifier des antiviraux potentiels. Les recherches futures se concentreront sur l'amélioration de ces stratégies thérapeutiques et l'exploration plus approfondie de leur application à d'autres coronavirus, dans le but d'améliorer la santé animale et de réduire leur impact économique.