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Mélissa Bessonne (équipe Corona) a le plaisir de vous convier à sa soutenance de thèse intitulée "Développement et caractérisation fonctionnelle de nanoligands spécifiques de l’ARN-polymérase des virus influenza". Son travail de thèse a été réalisé sous la direction de Bernard Delmas.

La soutenance aura lieu le mardi 12 décembre 2023 à 14H00 dans l'amphithéâtre Jacques Poly du bâtiment 440 à l’INRAE de Jouy-en-Josas. Il sera aussi possible de suivre la soutenance en visio grâce au lien suivant : https://inrae-fr.zoom.us/j/91843791408

Le jury est composé de : Frédérick Arnaud (Directeur de recherche, Université Lyon 1), Marc Jamin (Professeur des Universités, Université Grenoble-Alpes), Nadia Naffakh (Directrice de recherche, CNRS), Delphine Sitterlin (Maitresse de conférence, Université Versailles Saint-Quentin).

Résumé : Chaque année, les virus Influenza A saisonniers sont responsables de millions d’infection grippale et de centaines de milliers de décès chez l’homme dans le monde.

Le génome du virus Influenza A (IAV) est composé de huit segments d’ARN monocaténaires (de 0,8 à 2,3 kb de longueur) de polarité négative. Ces segments sont associés à de nombreuses copies de la nucleoprotéine N pour former des complexes ribonucléoprotéiques viraux (vRNPs) avec l’ARN-polymérase virale (FluPol) fixée à chacun d’eux par leurs extrémités 5’ et 3’. FluPol est composée de trois sous-unités, PA, PB1 et PB2 qui s’associent pour former un core autour duquel plusieurs domaines périphériques se positionnent différemment en fonction de son type d’activité (transcription, réplication, ou inactive dans la particule virale).

Le cycle de réplication des virus influenza est complexe. Suite à l’attachement des particules virales à la surface cellulaire et à leur transfert dans le cytoplasme, les vRNPs sont transloquées dans le noyau où transcription et réplication virales sont réalisées. L’activité ARN-polymérase de FluPol est commune à ces deux fonctions, une activité « vol de coiffe » étant aussi réalisée par FluPol pour capturer l’extrémité 5’ des ARNm cellulaires et amorcer la transcription virale. Les ARNm viraux sont ensuite exportés du noyau vers le cytoplasme où ils sont traduits. Les sous-unités de FluPol et NP néosynthétisées sont ensuite transloquées au noyau où ils s’assemblent pour assurer transcription secondaire, réplication et assemblage de nouveaux complexes vRNPs.

Pour caractériser la dynamique du fonctionnement de FluPol et identifier à sa surface de nouveaux sites pouvant être ciblés pour bloquer ses activités, mes travaux de thèse ont visé à la sélection de nanoligands spécifiques de FluPol et à l’analyse de leurs propriétés fonctionnelles sur le cycle viral. J’ai ainsi sélectionné et caractérisé deux types de nanoligands : 1. des nanobodies/VHH issus d’anticorps de camélidés à domaines uniques issus d’une immunisation d’un lama, 2. des protéines artificielles nommées aReps criblées par « phage display » et spécifiques du core et des domaines périphériques de FluPol. J’ai sélectionné 7 VHHs spécifiques du dimère de FluPol, PA-PB1. Certains de ces VHH exprimés dans le cytosol inhibent l’activité de FluPol de virus influenza A, mais pas de son homologue influenza B. VHH16, le plus performant, se fixe préférentiellement au dimère PA-PB1 plutôt qu’à ses constituants monomériques, et avec une affinité inférieure au nanomolaire. L’expression de VHH16 dans des cellules permissives au virus montre que ce VHH bloque la multiplication de plusieurs sous-types viraux (H1N1, H3N2 et H7N1), et ceci même quand son expression est induite à des temps tardifs post-infection. VHH16 altère le transport du dimère PA-PB1 au noyau, sans affecter sa prise en charge par l’importine RanBP5 ou des étapes ultérieures de l’assemblage de FluPol. Ces travaux suggèrent que l’activité « neutralisante » du VHH16 est dû à une altération du transport du dimère PA-PB1 au noyau, provoquant ainsi une inhibition du fonctionnement de FluPol.

En parallèle, j’ai criblé par « phage display » une banque de protéines artificielles appelées αReps contre le core et ses domaines périphériques PB2-CBD, PB2-627 et PB2-NLS ; PB2-CBD étant le domaine de FluPol se fixant à la coiffe des ARNm cellulaires, PB2-627 se liant à ANP32A pour assurer la réplication virale, et PB2-NLS pour assurer son transport au noyau. Plusieurs αReps (C3-CBD, F3-627 et plusieurs αReps anti-NLS) se sont avérés bloquer l’activité de FluPol dans un test d’activité in cellulo. C3 et F3 se sont révélées agir en synergie quand elles étaient fusionnées sous les formes F3-C3 ou C3-F3. L’expression ectopique de ces deux αReps bloquent la multiplication de virus des trois sous-types mentionnés au-dessus. Les bases moléculaires de l’activité inhibitrice de ces αReps et du VHH16 restent à élucider.

Keywords : ARN-polymérase, virus influenza, nanoligands, VHH, nanobody, protéine artificielle, neutralisation intracellulaire